Инженерство на ензими, свързано с растеж, чрез манипулация на регенерация на редокс кофактора

Все по-широк спектър от химикали вече се произвежда от възобновяеми суровини чрез биотехнологични средства. Биопроцесите силно разчитат на ензимна катализа за ефективното производство на тези съединения. Осигуряването оптимална работа на ензимите в необходимата среда е от голям интерес за устойчивото производство.

Свойства като специфичност на субстрата, каталитична скорост и (термо)стабилност са сред няколко критични фактора, които трябва да бъдат оптимизирани за ефективни ензимно-задвижвани биопроцеси. Тази оптимизация може да бъде времеемка, скъпа и предизвикателна, и затова ефективни и икономични начини за селекция, свързана с растеж, инженерните ензими с желани характеристики са много търсени.

Предимствата на използването на растежно-свързания подбор като форма на ензимен подбор, който включва свързване на активността на ензима с растежа на клетката. Този метод може да се използва като стратегия за селекция с висока производителност и може да се постигне чрез гарантиране, че растежът зависи от синтеза на продукта от целевия ензим, или чрез свързване на активността на ензима с глобалното енергийно състояние на клетката. Синтетичната биология може да се използва за инженеринг на щамове, подходящи за селекция чрез растежна свързаност, а последните постижения са насочени към инженерни щамове, дефицитни в окислените или редуцираните състояния на редокс кофакторни двойки, които могат да служат като ензимни инженерни платформи. Използването на тези платформи може да ускори разработването на подобрени биокатализатори и биопроцеси.

Ползи от растежното свързване чрез кофакторна ауксотрофия

Ползите от използването на кофакторна ауксотрофия като метод за подбор за инженерни ензими, участващи в биосинтезата на определени химикали, като липиди, биогорива, газове, органични разтворители или полимерни съединения. Този подход предлага няколко уникални предимства, включително възможност за избор на желания продукт независимо от интересуващия субстрат или продукт, което улеснява откриването на подобрена ензимна активност и предлага показания за откриване на подобрена ензимна активност. Освен това, използването на кофакторни ауксотрофи като платформи за растежно свързване е полезно, тъй като повсеместната природа на редокс кофакторите в микробния метаболизъм означава, че инженерните стратегии могат да бъдат странично преносими към други интересуващи микроби, а ензимите могат да бъдат директно инженерни в средата на желания микробен гостоприемник. (показана като фигура 1)

Фигура 1: Сравнение на няколко широко използвани техники за скрининг/селекция за ензимно инженерство

Мутанти с дефицит на NADH окисляване

Окисляването на NADH в E. coli може да се осъществи по два пътя, в зависимост от наличието на кислород. При аеробни условия NADH се окислява основно чрез дишане за генериране на ATP, докато при анаеробни условия може да се окислява чрез ферментационни пътища за производство на лактат и етанол. Мутантни щамове на E. coli, които не могат да използват смесени ферментационни пътища за окисляване на NADH по време на анаеробен растеж, са използвани за задвижване на NADH окисляващи пътища за анаеробния синтез на различни химикали, като 2-метилпропан-1-ол, 2,3-бутандиол, 1-бутанол и L-аланин. Тези мутантни щамове са използвани и за инженерство на ензими чрез използване на подобни редокс принципи, което води до подобрени варианти. Получените щамове могат да се използват за инженерство на други ензими и пътища, зависими от NAD(P)H.

Мутанти с дефицит на NAD+  

Венк и съавтори създават щам E. coli чрез изтриване на гена дихидролипойл дехидрогеназа (lpd), което води до неспособността на щама да генерира редуцираща сила (NADH и NADPH) от метаболизма на ацетатите поради липса на активност на пируват дехидрогеназа. Това причиняваше ауксотрофията на щама за намаляване на мощността, когато се отглежда аеробно върху ацетат като единствен източник на въглерод. (показана като фигура 2) Щамът можеше да расте върху ацетат, когато е допълнен с горни гликолитични субстрати или при експресия на NAD+-зависими формати, етанол- или метанолдехидрогенази с техните съответни субстрати. Щамът не беше използван за ензимно инженерство и беше оценен само за редокс кофактор ауксотрофия.
 

Фигура 2: Централен метаболизъм 

Мутанти с дефицит на NADPH окисляване

Съществуват две различни стратегии за индуциране на NADP+ ауксотрофия при E. coli, като се разчита на инженерството на гликолитичния път за прекомерно производство на NADPH. Първата стратегия включва изтриване на естествения ген gapA и експресия на хетерологичен NADP+-зависим ензим GAPDH, докато втората стратегия включва пренасочване на въглеродния поток през пътя на пентозофосфатния път. Получените щамове не могат да растат върху глюкоза, но показват растеж при различни условия, като първият щам се отглежда при анаеробни условия, а вторият при аеробни условия с глицерол като субстрат. Тези щамове се използват за инженерни ензими с подобрени свойства, включително специфичност към субстрата, каталитична активност и термостабилност.

Мутанти с дефицит на NADP+

Три различни бактерии – E. coli, P. putida и C. glutamicum – са инженерно разработени да бъдат NADPH-ауксотрофни, което означава, че се нуждаят от екзогенен NADPH за растеж. В случая с E. coli и C. glutamicum, централните метаболитни ензими бяха елиминирани, за да се избегне намаляване на NADP+, когато глюкозата беше предоставена като въглероден източник, докато при P. putida инженерството с подпомагане на CRISPR/nCas9 беше използвано за последователно нарушаване на набори от целеви гени с цел разбиране на тяхното участие в редокс метаболизма. След това NADPH-ауксотрофните щамове бяха използвани за инженерство на ензими, свързани с растеж, базирано на специфичността на кофактора. Един кръг мутагенеза с E. coli даде най-ефективния и специфичен NADP+-зависим формат дехидрогеназа до момента, докато P. putida и C. glutamicum представляват първите щамове от техния вид, които могат да се използват за този тип инженерство.

Мутанти с дефицит на NMN+

Разработена е система за селекция, свързана с растеж, която свързва цикъла на кофакторите и растежа въз основа на дефицит в редукцията на NMN+. Използван е щамът E. coli SHuffle, който носи делеции в два гена, участващи в производството на редуциран глутатион. Чрез рационална мутагенеза беше разработена NMNH-зависимата глутатион редуктаза, за да се свърже процесът с циклирането на NMN+/NMNH, а NMN+-зависима глюкоза дехидрогеназа беше използвана за подпомагане на циклирането на NMN+/NMNH кофактора и съответно растежа. Изследването също така приложи неканонична редокс кофакторна ауксотрофия за ензимно инженерство с растежно свързано образование, което доведе до термостабилен вариант на фосфит дехидрогеназа с подобрена каталитична ефективност и времева стабилност in vitro. Работата предоставя полезен щам за инженерство на ензими, свързани с растеж, зависимо от циклиране на NMN+/NMNH и ауксотрофно за редуцирането на неканоничен редокс кофактор.

Потенциалът на растежното свързване чрез редокс кофактори работи като мощен инструмент за инженеринг на биокатализатори, особено в контекста на устойчиво биопроизводство. Въпреки че е постигнат значителен напредък в създаването на редокс кофакторни ауксотрофни щамове, изявлението предполага, че все още има няколко неизследвани направления за изследвания. Един от тях включва инженерство на кофакторни ауксотрофни щамове на организми, различни от E. coli, което може да отвори нови възможности за инженерство на ензими, свързани с растеж.

Като цяло тя предполага, че използването на редокс кофактор за растежно свързване представлява голяма възможност за инженерна биокатализа, особено за производство на продукти, които не могат да отговорят на изискванията на други високопродуктивни ензимни инженерни подходи. Той подчертава необходимостта от разработване на по-гъвкави и ефективни биокатализатори за устойчиво биопроизводство и подчертава значението на продължаващите изследвания в тази област.


Източник: Йохем Р. Нилсен а, Рууд А. Веустхюис б, Уей Е. Хуанг а, Инженерство на ензими, свързани с растеж чрез манипулация на регенерация на редокс кофактори, Biotechnology Advances, 2023.