优化反应条件以实现甜叶菊Rebaudioside D的高产率
Диетите с високо съдържание на захар доведоха до нарастващо разпространение на различни хронични заболявания, включително затлъстяване, диабет, сърдечно-съдови заболявания и хипертония, което представлява значителен глобален проблем за общественото здраве. Stevia Rebaudioside D (Reb D), естествен подсладител, получен от растения, привлече значително внимание като заместител на захарта поради нулевото си калорично съдържание, интензивната сладост и приятния вкусов профил.
Въпреки това, ограниченото му присъствие в Stevia rebaudiana Bertoni и предизвикателствата, свързани с ниската разтворимост и ензимната активност на растително-произхождащия гликозилтрансфераза, възпрепятстваха широкото му търговско приложение. В отговор на тези проблеми беше открита нова гликозилтрансфераза, наречена YojK, произхождаща от Bacillus subtilis 168. Това проучване представя генетично модифицирана бактериална гликозилтрансфераза, YojK-I241T/G327N, характеризираща се с висока разтворимост и каталитична ефективност, предлагайки голям потенциал за промишлено производство на Reb D.
Разработването на високоефективен метод за производство на ребаудиозид D чрез каскадна реакция на ензимите YojK-I241T/G327N и AtSuSy.
За да се справят с проблема с ниската разтворимост на растително-произхождащите гликозилтрансферази, изследователите проучиха потенциала за използване на YojK, O-гликозилтрансфераза от Bacillus subtilis 168. YojK беше избран поради демонстрираната му гликозилираща активност с различни субстрати, включително големи молекули. След успешна рекомбинантна експресия и пречистване, YojK беше използван за гликозилиране на Reb A, което доведе до производството на Stevia Reb D. Ензимният кинетичен анализ разкри, че YojK има по-ниска каталитична активност към Reb D в сравнение с други гликозилтрансферази. Следователно, проучването предполага необходимостта от структурно-насочено инженерство за подобряване на каталитичната активност на YojK за потенциални практически приложения. (както е показано на Фигура 1)
Фигура 1
Оптимизирането на реакционните условия за постигане на висок добив на ребаудиозид D.
Реакционните условия, включително pH, температура и концентрация на субстрата, могат да бъдат оптимизирани за постигане на висок добив на Srevia Reb D. Проучването използва молекулярно-динамични симулации, за да изследва как вариантът YojK-I241T/G327N подобрява гликозилирането на Reb D. Вариантът поддържа стабилна водородна връзка между Reb A и H14 по време на симулациите, за разлика от дивия тип (както е показано на Фигура 2). Тази стабилност се разпростира и върху разстоянието между O2 атома на Reb A и C1P на UDPG. Подобрената каталитична ефективност на варианта YojK-I241T/G327N се приписва на тези стабилни взаимодействия, което предполага неговия практически потенциал.
Фигура 2
Фигура 3
Заключение
Този подход доведе до 83.47% Reb D. Забележително е, че добавянето на 1 mM UDPG позволи синтеза на 20.59 g/L Reb D със забележителен добив от 91.29%, надминавайки предишни проучвания. Този процес демонстрира потенциала за промишлено производство на Reb D, особено след структурното инженерство на YojK.YojK може да бъде ефективно експресиран в E. coli BL21 (DE3) с висока разтворимост. Чрез структурно-насочено инженерство беше създаден двоен мутант, YojK-I241T/G327N, позволяващ мащабно производство на Reb D с изключителен добив от 91.29% чрез рециклиране на UDPG, катализирано от захарозна синтаза AtSuSy. Това проучване представя YojK-I241T/G327N като обещаващ инструмент за икономически ефективно промишлено производство на Reb D.
