Оптимизация на реакционните условия за постигане на висок добив на стевия ребаудиозид D
Диетите с високо съдържание на захар доведоха до нарастваща честота на различни хронични заболявания, включително затлъстяване, диабет, сърдечно-съдови заболявания и хипертония, което представлява значителен глобален общественоздравен проблем. Stevia Rebaudioside D (Reb D), натурален подсладител, извлечен от растения, привлича значително внимание като заместител на захарта заради съдържанието си без калории, интензивната сладост и приятния вкусов профил.
Въпреки това, ограниченото му присъствие в stevia rebaudiana Bertoni и предизвикателствата, свързани с ниската разтворимост и ензимната активност на растителната гликозилтрансфераза, възпрепятстват широкото ѝ търговско приложение. В отговор на тези проблеми беше открита нова гликозилтрансфераза, наречена YojK, произхождаща от Bacillus subtilis 168. Това изследване въвежда генетично модифицирана бактериална гликозилтрансфераза, YojK-I241T/G327N, характеризираща се с висока разтворимост и каталитична ефективност, предлагаща голям потенциал за индустриално производство на Reb D.
Разработване на високоефективен метод за производство на ребаудиозид D чрез каскадна реакция на ензими YojK-I241T/G327N и AtSuSy.
За да се реши проблема с ниската разтворимост в растителни гликозилтрансферази, изследователи изследват потенциала на използването на YojK, O-гликозилтрансфераза от Bacillus subtilis 168. YojK беше избран заради доказаната си гликозилационна активност с различни субстрати, включително големи молекули. След успешна рекомбинантна експресия и пречистване, YojK беше използван за гликозилиране на Reb A, което доведе до производството на Stevia Reb D. Ензимният кинетичен анализ показа, че YojK има по-ниска каталитична активност спрямо Reb D в сравнение с други гликозилтрансферази. Следователно изследването предполага необходимостта от структурно ориентирано инженерство за повишаване на каталитичната активност на YojK за потенциални практически приложения. (както е показано на Фигура 1)
Фигура 1
Оптимизация на реакционните условия за постигане на висок добив на ребаудиозид D.
Условията на реакцията, включително pH, температура и концентрация на субстрата, могат да бъдат оптимизирани за постигане на висок добив на Srevia Reb D. Изследването използва молекулярни динамични симулации, за да се проучи как вариантът YojK-I241T/G327N засилва гликозилирането на Reb D. Вариантът поддържаше стабилна водородна връзка между Reb A и H14 по време на симулации, за разлика от дивия тип (както е показано на Фигура 2). Тази стабилност се простираше и до разстоянието между O2 атома на Reb A и C1P на UDPG. Подобрената каталитична ефективност на варианта YojK-I241T/G327N се дължи на тези стабилни взаимодействия, което подсказва практическия му потенциал.
Фигура 2
Фигура 3
Заключение
Този подход даде 83,47% Reb D. Забележително е, че добавянето на 1 mM UDPG позволи синтез на 20,59 g/L Reb D с впечатляваща добива от 91,29%, надминавайки предишните изследвания. Този процес демонстрира потенциала за индустриално производство на Reb D, особено след конструктивното инженерство на YojK.YojK може ефективно да се експресира в E. coli BL21 (DE3) с висока разтворимост. Чрез структурно ориентирано инженерство беше създаден двоен мутант, YojK-I241T/G327N, който позволи мащабното производство на Reb D с изключителен добив от 91,29% чрез рециклиране на UDPG, катализиран от сахарозсинтаза AtSuSy. Това изследване представя YojK-I241T/G327N като обещаващ инструмент за икономически ефективно производство на Reb D в индустриален мащаб.
