Количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити в ишиасните нерви на мишите
Въведение
Ключовите части на никотинамид аденин динуклеотид (NAD+) и неговите метаболити при стареене и невродегенерация са широко признати. За да се стимулира напредъкът към биохимични изследвания и интервенции, насочени към стареене и невродегенеративни заболявания, е от голямо значение точното количествено определяне на NAD+ и нивата на метаболити в пътя на спасяване на NAD+. Тук се прилага стабилен и точен метод LC-MS/MS за количествено определяне на нивата на NAD+ и неговите метаболити в нормален и увреден седалищен нерв на мишка.Ограничения на съществуващите методи за количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити
Традиционните методи за количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити, като HPLC-UV, NMR, електрофореза в капилярна зона или колориметрични ензимни тестове, се сблъскват с различни предизвикателства в областта на чувствителността, селективността и индиректното измерване. Що се отнася до съществуващите LC-MS/MS тестове за клетъчни или тъканни измервания на NAD+ и неговите метаболити, все още има много трудности за преодоляване, като удължено време за изпълнение, лошо хроматографско задържане и незадоволителни форми на пиковете. Освен това, само едно до три вещества в пътя на спасяване NAD+ могат да бъдат покрити с тези методи.Модификациите на метода LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Освен това, MS условията са оптимизирани да минимизират NAD+ интерференционния сигнал в цикличния аденозиндифосфатен рибозен канал (cADPR), като същевременно се запазва отговорът на cADPR и никотинамидния мононуклеотид (NMN), с 4000V за йонно напрежение, 450°C за температура на турбонагревателя, 50 psi за газ 1, 50 psi за газ 2, 30 psi за завесен газ и 12 psi за газове при сблъсък.
Представителна хроматограма на нервни проби (нормални срещу наранени)
Всички пет анализа постигат базово разделяне, където cADPR е чувствителен биомаркер в невродегенерационния модел. Тук аксотомията на седалищния нерв предизвиква аксонална дегенерация, водеща до намалено ниво на NAD+ и повишено ниво на NMN в увредените нерви, което води до около 2 пъти увеличение на съотношението NMN/NAD+. Едновременно с това нивата на никотинамид (NAM) и аденозин дифосфатна рибоза (ADPR) се намаляват около 2 пъти, докато нивото на cADPR се увеличава повече от 8 пъти. Тези резултати са в съответствие с тези от по-рано докладвани изследвания, които потвърждават точността на този модифициран метод LS-MS/MS при количественото определяне на NAD+ и неговите метаболити.
Заключение
Този модифициран метод LC-MS/MS позволява ефективно базово разделяне на NAD+, NMN, NAM, ADPR и cADPR за кратък период от 5 минути, което допринася за ранна диагностика на различни неврологични заболявания и разработване на лекарства за стареене и невродегенеративни заболявания.Референция
Ma Y, Deng L, Du Z. Разработване и валидиране на метод LC-MS/MS за количествено определяне на NAD+ и сродни метаболити в седалищни нерви на мишки и приложението му към животински модел с нервно увреждане. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC от 2012 г. е посветена на научноизследователската и развойна дейност, производството и продажбата на суровини за коензими и природни продукти, с собствени фабрики, над 170 световни патента, както и силен екип за научноизследователска и развойна дейност. BONTAC разполага с богат опит в научноизследователската и развойна дейност и напреднали технологии в биосинтезата на NAD и неговите предшественици (напр. NMN и NR). Има различни видове NAD, които трябва да се изберат, включително NAD ER Grade (премахване на ендоксин), NAD Grade I (IVD/хранителна добавка/козметичен суров прах), NAD Grade II (API/междинни продукти) и NAD Grade IV (ако има по-високи изисквания за разтворимост), които могат да се предоставят под формата на лиофилизиран прах или кристален прах. Чистотата на BONTAC NAD може да достигне над 98%.
