小鼠坐骨神经中 NAD+ 及其代谢物的定量分析
引言
Ключовата роля на никотинамид аденин динуклеотид (NAD+) и неговите метаболити в стареенето и невродегенерацията е широко призната. За да се стимулира напредъкът към биохимични изследвания и интервенции, насочени към стареенето и невродегенеративните заболявания, от голямо значение е точното количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити в пътя на спасяване на NAD+. Тук се прилага стабилен и точен LC-MS/MS метод за количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити в нормален и увреден миши седалищен нерв.Ограничения на съществуващите методи за количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити
Традиционните методи за количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити, като HPLC-UV, NMR, капилярна зонна електрофореза или колориметрични ензимни анализи, се сблъскват с различни предизвикателства по отношение на чувствителността, селективността и индиректното измерване. Що се отнася до съществуващите LC-MS/MS анализи за клетъчни или тъканни NAD+ и неговите метаболити, все още има много трудности за преодоляване, като удължени времена на анализ, лошо хроматографско задържане и незадоволителни форми на пиковете. Освен това само едно до три вещества в пътя на спасяване на NAD+ могат да бъдат обхванати от тези методи.Модификации на LC-MS/MS метода
Въз основа на съществуващите LC-MS/MS анализи са направени модификации по отношение на хроматографските условия, заместващата матрица и MS/MS условията. По-конкретно, 5 μM метиленфосфонова киселина се използва като добавка към подвижната фаза, която изрично подобрява интензитета на сигнала и формата на пиковете. Предвид относително чистия и прост характер на нервните проби и техния малък размер, свръхчиста вода се тества като заместваща матрица. Вместо хидрофилна интерактивна течна хроматографска колона и hypercarb колона, се използва колона Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, чиято уникална MaxPeak HPS високоефективна повърхностна технология (пасивираща вътрешната стена на колоната, елиминираща металната повърхност) позволява висока възпроизводимост, симетрия на пиковете и базово разделяне на всички аналити.Освен това MS условията са оптимизирани, за да се минимизира интерферентният сигнал на NAD+ в канала на цикличния аденозин дифосфат рибоза (cADPR), като същевременно се поддържа отговорът на cADPR и никотинамид мононуклеотид (NMN), с 4000V за йонно спрей напрежение, 450℃ за температура на турбо нагревателя, 50 psi за Газ 1, 50 psi за Газ 2, 30 psi за завеса газ и 12 psi за колизионен газ.
Представителна хроматограма на нервни проби (нормални срещу увредени)
Всичките пет аналита постигат базово разделяне, като cADPR е чувствителен биомаркер в модела на невродегенерация. Тук аксотомията на седалищния нерв индуцира аксонална дегенерация, водеща до намалено ниво на NAD+ и повишено ниво на NMN в увредените нерви, което води до около 2-кратно увеличение на съотношението NMN/NAD+. Едновременно с това нивата на никотинамид (NAM) и аденозин дифосфат рибоза (ADPR) са намалени около 2 пъти, докато нивото на cADPR е увеличено с повече от 8 пъти. Тези резултати са в съответствие с тези от предишни изследвания, потвърждавайки точността на този модифициран LS-MS/MS метод за количествено определяне на NAD+ и неговите метаболити.
Заключение
Този модифициран LC-MS/MS метод позволява ефективно базово разделяне на NAD+, NMN, NAM, ADPR и cADPR в рамките на кратко време на анализ от 5 минути, което допринася за ранна диагностика на различни неврологични разстройства и разработване на лекарства за стареене и невродегенеративни заболявания.参考文献
Ma Y, Deng L, Du Z. Development and validation of an LC-MS/MS method for quantifying NAD+ and related metabolites in mice sciatic nerves and its application to a nerve injury animal model. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACе посветен на научноизследователска и развойна дейност, производство и продажба на суровини за коензими и натурални продукти от 2012 г., със собствени фабрики, над 170 глобални патента, както и силен екип за научноизследователска и развойна дейност. BONTAC има богат опит в научноизследователската и развойна дейност и модерни технологии в биосинтезата наNAD и неговите прекурсори(напр. NMN и NR). Има различни видове NAD за избор, включително NAD ER клас (отстраняване на ендотоксини), NAD клас I (IVD/хранителна добавка/козметична суровина на прах), NAD клас II (API/междинни продукти) и NAD клас IV (ако има по-високо изискване за разтворимост), които могат да бъдат предоставени под формата на лиофилизиран прах или кристален прах. Чистотата на BONTAC NAD може да достигне над 98%.
